吴文亮 1,2,3,4，刘仲华 1,2,3*，林勇 1,2,3*，黄建安 1,2,3，
左高隆 1,2， 滕翠琴 5，龙志荣 6，邱瑞瑾 5，曹中环 5
1. 湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；
3. 植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128；4. 湖南省农业科学院茶叶研究所，湖南 长沙 410125；
5. 梧州市六堡茶研究院，广西 梧州 543003；6. 梧州市茶产业发展办公室，广西 梧州 543003
摘要：
为了探讨陈年六堡茶的调脂保肝功效，比较分析了不同年代六堡茶的主要化学物质的差异，再以高脂高糖饮食建立高脂血症小鼠模型， 并用选定的陈年六堡茶水提物灌胃小鼠，观察小鼠相关生理生化指标及组织形态的变化。结果表明，陈化 15 年茶样被选为陈年六堡茶的代表，用于后续试验。与模型组相比，陈年六堡茶尤其中高剂量条件下能有效减轻高脂血症小鼠体重、肝重和降低肝系数，显著提高高密度脂蛋白-胆固醇
（HDL-C）含量，降低血清中总胆固醇（ TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）含量，降低谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活力，改善大鼠肝脏氧化应激状态，具有统计学意义（P<0.05 或P<0.01）。肝脏和脂肪组织病理切片显示，陈年六堡茶能明显减少肝细胞中脂滴的形成和抑制脂肪细胞膨大， 呈剂量依赖关系。综上表明，陈年六堡茶在正常剂量条件下能有效改善因高脂高糖饮食所致的小鼠脂质代谢紊乱和肝脏损伤。
关键词：
陈年六堡茶；高脂血症；脂质代谢；肝损伤；改善作用。
中图分类号：TS272.5+9 文献标识码： A 文章编号：1000-369X（2018）04-430-09
六堡茶属黑茶类，是广西具有地理标志及浓郁地方特色的名优农产品[1-2]，原产于广西梧州市苍梧县六堡镇，生产历史悠久，风味独特，是广西传统的出口产品[3-4]。近年来，随着黑茶的热销，六堡茶因“红、浓、陈、醇” 的独特品质特征深受消费者青睐[5]，品牌价值不断提升，目前年产量已超 1.2 万 t，产值达12.8 亿元以上。
随着当前百姓生活水平提高，高脂高糖饮食增加，是造成近年来机体脂质代谢紊乱、非酒精性脂肪肝及肥胖等代谢综合征高发的主要原因[6]。国内外大量研究[7-10]表明，茶及其内含成分具有调脂保肝作用，其中绿茶和红茶相关报道最多。素有“越陈越好”的黑茶主要以普洱茶和茯砖茶相关研究较多[11-13]。近年来随着六堡茶品牌价值的提升，也有了六堡茶调脂保肝相关功效研究的报道[14-16]，但是选用的都是年代较新的茶样。虽然六堡茶如同其他黑茶（普洱茶、茯砖茶等）一样都有“越陈越好” 的说法，但是随着陈化时间的增加，它们的主要化学物质含量下降[17-20]。刘泽森等[20]指出六堡茶随陈化年份的延长其水浸出物、茶多酚、氨基酸、茶黄素及茶红素等物质呈逐渐下降的趋势。目前，已有的文献对“越陈越好” 的解释还只是基于感官审评的综合评分上，如“越陈越香”或/和“越陈越醇”[20-21]。考虑到功效由化学物质基础决定，陈年六堡茶在降脂保肝方面到底有没有效果一直没有明确的数据支持。鉴于此，本研究选取了陈化时间较长，并且具代表性的六堡茶样作为试验材料，基于高脂血症小鼠模型全面评估陈年六堡茶的调脂护肝作用，以期为陈年六堡茶甚至陈年黑茶的品质和功效的研究提供试验依据，为健康饮茶及六堡茶产业发展提供科技支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 茶叶样品
六堡茶均为广西壮族自治区梧州茶厂提供的同一级别散茶，分别陈化 1、5、10、15 年，每个年代茶样取 3 个重复。
1.1.2 试验动物
SPF级雄性昆明种（KM）小鼠，体质量20 g 左右，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002。
1.1.3 饲料配方
高脂高糖饲料：参照《保健食品检验与评价技术规范-辅助降血脂功能评价方法》（2012 年修订），配方为基础饲料 63.6%、蔗糖 20.0%、猪油 15.0%、胆固醇 1.2%、胆酸钠 0.2%。
1.2 仪器与试剂
试剂：总胆固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol， LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate transaminase，AST）以上试剂购自上海科华生物工程股份有限公司；谷胱甘肽 过 氧 化 物 酶 （ Glutathione peroxidase ， GSH-Px）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD） 试剂盒购自南京建成生物工程研究所；血脂康胶囊购自北京北大维信生物科技有限公司。
仪器： MIKRO 22R 冷冻离心机（德国Hettich 公司）、TBA-40FR 全自动生化分析仪（日本东芝公司）、Modulyod-230 冷冻干燥机（美国 Thermo 公司）、DM2000 生物显微镜（德 国Leica 公司）、Thermo Scientific Varioskan Flash 酶标仪（美国 Thermo 公司）、UV-2550 紫外分光光度计（日本 Shimadzu 公司），AEU-210 湘仪电子天平（长沙湘仪天平仪器公司）、F6/10 超细匀浆机（德国 FLUKO 公司）、解剖器械等。
1.3 试验方法
1.3.1 茶样干粉制备
取适量六堡茶样品，按料液比 1∶10，浸提3 次（沸水），每次浸提时间为 20 min，纱布过滤，合并浸提液，减压浓缩至一定体积， 于–20℃预冻 12 h，放入冷冻干燥机干燥 24 h， 收集茶粉，密封包装，–20℃保存。
1.3.2 主要成分指标测定
茶叶中主要成分指标测定参照 GB/T8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》、GB/T 8302—2002《茶水浸出物测定》、GB/T 8314—2002《茶游离氨基酸总量测定》、GB/T 8312—2002《茶咖啡碱测定》；可溶性糖测定参照文献[4-5,9]：蒽酮比色法；茶色素的测定参照文献[22]：系统分析法。
1.3.3 动物模型构建及分组给药
参考已有研究建立本试验动物模型及分组给药[8, 12, 23]。KM 小鼠经适应性喂养 7 d 后， 对体质量偏差较大的小鼠进行初步剔除后的60 只小鼠随机分为 6 组，每组 10 只，即模型组、正常组、阳性组及六堡茶的低、中、高剂量干预组。正常组给予基础饲料，其他组给予高脂高糖饲料。采用脂代谢紊乱预防模型，同时给药与喂食，六堡茶的低、中、高剂量处理组每日分别给予灌胃 158、316、632 mg·kg-1 茶叶水提物。剂量选择[9, 24-25]：选择茶叶人体推荐量（成人 60 kg 每日饮用 10 g 干茶，即166.7 mg·kg-1）的 5、10、20 倍为给六堡茶的低、中、高剂量浓度。因此，每只小鼠每日给予茶粉（茶叶水提物冻成干粉）剂量（ mg·kg-1）=166.7×倍数×浸提率。阳性药物组给予每日灌胃 137 mg·kg-1 血脂康，阳性药成人（60 kg）每日推荐剂量为 15 mg·kg-1，换算为小鼠的剂量（小鼠等效剂量相当于人的 9.1 倍），即为137 mg·kg-1。正常对照组和模型对照组均给予灌胃等量蒸馏水。每只小鼠按 0.01 mL·g-1 的容量灌胃，每天灌胃 1 次，连续 35 d，每周称体质量 1 次。
1.3.4 样品的采集及制备[9,12,26]
（1） 血清的制备：最后一次给药后禁食不禁水 24 h，麻醉后摘眼球取血，放入离心管中，4℃下静置一段时间后，在 4℃下 3 000 r·min-1离心 15 min，离心后取血清待测各项指标。
（2） 肝组织匀浆制备：取出肝组织，在冷的生理盐水中漂洗，除去血液，用滤纸拭干后称量。称取约 0.2 g 肝组织加生理盐水，用细胞破碎仪制备 10%肝匀浆液。4℃下 3 000 r·min-1 离心 10 min，离心好后用移液器取上清液。分装贮存于–80℃冰箱备用。
（3） 小鼠肝脏和脂肪组织病理切片制备：分别取小鼠同一部位肝脏组织和睾丸周围脂肪组织，于 10%福尔马林液固定，固定后经流水冲洗数小时。制备石蜡切片，HE 染色， 显微镜下拍照观察。
1.3.5 血清与肝匀浆液中指标检测
血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT 及
AST 均采用全自动生化分析仪检测，肝匀浆中 MDA、SOD 及 GSH-Px 含量根据试剂盒要求进行检测。
1.3.6 数据处理与分析
应用单因素方差分析进行统计处理，采用SPSS 19.0 软件， 数据以平均值± 标准差 （ x ± s ）表示。组间比较采用 LSD 法；P<0.05，认为有统计学差异。
2 结果与分析
2.1 不同陈化年份茶样的主要化学成分测定结果
本试验选取了 4 个陈化年份（1、5、10、15 年）的六堡茶样品进行主要化学成分分析， 结果如表 1 所示，4 个不同年份的六堡茶主要化学成分，随着陈化年份的推移，其水浸出物、茶多酚、游离氨基酸、茶黄素（TFs）、茶红素（TRs）和可溶性糖含量呈现减少趋势； 咖啡碱和茶褐素（TBs）的含量呈现先上升后下降趋势，5 年份茶样的咖啡碱和茶褐素含量最高。与陈化 1 年茶样相比，5 年份茶样只有茶褐素的含量变化达到显著水平（P<0.05）；10 年份茶样只有茶多酚、茶红素和茶褐素的含量变化达到显著水平（P<0.05）；而 15 年份茶样测定的所有化学成分含量都急剧下降，除茶褐素外其他成分都达到显著水平（P<0.05或 P<0.01）。此外，六堡茶随着陈化时间的增加，(TFs+TRs)/TBs 比值呈现不断减小的趋势，表明在陈化过程中 TRs 和 TFs 会大量的转化为 TBs。根据已有研究指出黑茶调节脂质代谢的物质基础主要是茶多酚、茶褐素、茶多糖等[27]，同时鉴于陈化 15 年的六堡茶样与年代较近的茶样在内含物质成分（调脂功效的主要物质）含量上的显著差异，为了验证其是否仍然有很好的调脂护肝功效，故 15 年茶样被选作陈年六堡茶代表用于后续试验。
2.2 陈年六堡茶对小鼠体重与肝脏指数的影响
结果如表 2 所示，高脂模型组的终体质量、肝质量以及肝系数值都极显著（P<0.01） 高于正常组小鼠。然而，六堡茶水提物各剂量组的小鼠终体质量、肝质量及肝系数值全面降低且呈剂量依赖关系，尤其高剂量组所有指标变化均具有统计学意义（P<0.05 或 P<0.01），说明陈年六堡茶水提物能有效控制小鼠体重、肝重增加以及肝系数的增大。
2.3 陈年六堡茶对小鼠血脂的影响
陈年六堡茶对小鼠血清血脂水平的影响见表 3 所示。模型对照组小鼠 TG、TC、LDL-C 含量极显著（ P<0.01） 高于正常对照组， 而HDL-C 含量极显著下降（P<0.01），表明本试验采用的高脂高糖饮食方法使小鼠呈现了高脂血症状。而与模型组相比，给予低剂量陈年六堡茶对小鼠血清 TG、TC、LDL-C 和 HDL-C 水 平 有 改 善 作 用 ， 但 没 达 到 显 著 水 平（P>0.05）；给予中剂量陈年六堡茶小鼠血清TG 和 LDL-C 水平显著降低（P<0.05）；而高剂量组小鼠血清中 TG、TC、LDL-C 和 HDL-C 含量均达到显著差异（P<0.05）且 LDL-C 和HDL-C 含量接近正常组水平。这些结果表明陈年六堡茶尤其高剂量条件能有效调节小鼠的脂质代谢平衡。
2.4 陈年六堡茶对小鼠血清肝功能指标的影响
谷草转氨酶（ AST ）和丙氨酸转氨酶 （ALT）是肝功能的主要指标，检测 AST、ALT 的活性来反映肝组织实质受损程度。结果见表 4，与正常对照组相比，模型对照组小鼠血清 ALT、AST 活力均极显著升高（P<0.01）。与模型对照组相比， 给予陈年六堡茶水提物后，低、中、高 3 个剂量组的小鼠血清 ALT 和 AST 活性均有下降且呈剂量依赖关系，尤其中剂量条件下 AST 活性变化达到显著水平（P<0.05），高剂量条件下 ALT 和 AST 活性均显著下降（P<0.05 或 P<0.01）。由此可推断，陈年六堡茶能改善高脂血症模型小鼠的肝功能，可减轻肝脏组织受损程度。
2.5 陈年六堡茶对小鼠肝匀浆抗氧化指标的影响
结果显示（表 5），与正常对照组相比，高脂模型组肝匀浆中MDA 的含量极显著升高（P<0.01），SOD 和 GSH-Px 活力极显著下降（P<0.01），表明高脂高糖饮食使小鼠肝脏处于较强的氧化应激状态。与模型对照组相比， 给予陈年六堡茶水提物后，低、中、高 3 个剂量组的小鼠肝匀浆 MDA、SOD 和 GSH-Px 含量均有改善且呈剂量依赖关系，尤其中剂量条件下 MDA 含量显著下降和 SOD 活性显著上（P<0.05），高剂量条件下 MDA 含量显著下降和 SOD、GSH-Px 活性显著上升（P<0.05或 P<0.01）。这些结果表明陈年六堡茶可以通过提高肝细胞中 SOD、GSH-Px 活力改善肝脏氧化应激状态和抵抗机体脂质过氧化。
2.6 陈年六堡茶对小鼠肝组织形态的影响
图 1 可以看出，正常对照组小鼠肝脏质韧，色泽均匀，颜色暗红；模型对照组小鼠肝脏体积明显增大，质脆，呈土黄色；而陈年六堡茶各剂量组尤其高剂量组较模型组小鼠肝脏体积有所减小，质韧，色泽略偏红。HE 染色显示（图 2），正常对照组小鼠肝窦结构清晰，肝细胞大小较一致，肝细胞索排列整齐， 细胞核清晰、胞浆均匀。高脂模型组肝组织结构异常，肝细胞索排列紊乱，肝窦缩小甚至消失，肝细胞变大有明显的脂滴蓄积并伴有肿胀现象，细胞核位于细胞中央，胞浆呈空泡状。与模型对照组相比，灌胃低、中、高 3 个剂量陈年六堡茶后，试验小鼠肝细胞损伤程度有不同程度的改善且呈剂量依赖趋势，特别是中、高剂量组小鼠肝细胞索排列较整齐，细胞间界限较清晰，炎症细胞浸润减轻，肝细胞变性及肿胀程度降低，脂滴蓄积明显减少甚至消失， 已基本接近阳性对照组水平（图 2）。这些结果进一步表明陈年六堡茶能明显抑制高脂饮食引起的肝脏病变的作用，有效减少小鼠肝脏的脂肪堆积及减轻肝损伤情况。
2.7 陈年六堡茶对小鼠脂肪组织形态的影响
如图 3 所示，与正常对照组相比，模型对照组小鼠脂肪细胞形态不规则， 细胞明显膨大，脂肪细胞内充满脂滴。与模型对照组相比，
通过灌胃给予陈年六堡茶水提物后，低、中、高 3 个剂量组的小鼠细胞直径均有所减小，同一视野范围内脂肪细胞数量增加，且随着灌胃剂量的增大，改善效果越明显，特别是受试茶样高剂量组小鼠脂肪细胞大小基本接近于阳性对照组甚至正常对照组水平。这些结果提示陈年六堡茶能抑制脂肪细胞膨大和减少脂肪细胞内脂肪的累积。
3.讨论
已有研究[20]指出：六堡茶在陈化过程中（1~7 年），随陈化年份的推移其茶多酚、氨基酸、水浸出物、茶黄素（TFs）及茶红素（TRs）等物质呈逐渐下降的趋势；茶褐素（TBs）随着陈化年份的递增得到积累，呈上升趋势；咖啡碱在陈化过程中呈波动性变化，总体变化不大。本研究中，我们选取了陈化时间跨度更大的几个茶样（1、5、10、15 年），试验结果与上述结果基本保持一致；但是 TBs 的含量呈现先上升后下降趋势，陈化 5 年的茶样 TBs 含量最高，15 年最低。这些结果表明六堡茶在后发酵的陈化过程中，TFs、TRs 的量在前期一段陈化时间内茶色素变化总趋势下降，而
TBs 的量得到了积累；当后发酵的陈化时间过长后 TBs 也会发生进一步转化或分解，如生成一些不溶性物质[28]，导致 TBs 含量明显下降。同时，我们也发现了(TFs+TRs)/TBs 随着陈化时间的增加呈现不断减小的趋势，表明在陈化过程中 TRs 和 TFs 会大量的转化为 TBs， 这也与普洱茶在陈化过程中的变化趋势基本一致[17,29]，这个指标可能可用作评判六堡茶陈化时间长短的一个标准。
六堡茶作为黑茶家族中的一员，降脂减肥保肝作用同样是其最重要的一类功能；已有文献[14-16]表明了其在调脂保肝方面的作用，但是一般采用的都是年代比较新的茶样；而六堡茶随着陈化时间的增加，特别是长时间陈化，其目前已知主要内含物质成分都在减少。为探讨有“越陈越好”品质的六堡茶是否还具有调脂保肝效果，本研究通过对 4 个陈化时间（1、5、10、15 年）的茶样的主要化学成分含量比较分析，选取了与年代较新的茶样在内含物质成分含量上有显著变化的 15 年茶样作为陈年六堡茶的代表，用于后续动物试验。结果发现， 陈年六堡茶能够改善高脂血症小鼠的生理生化指标，尤其在中、高剂量条件下也就是小鼠对应人体推荐剂量的等效剂量和 2 倍等效剂量条件下能达到显著水平（P<0.05）。肝脏和脂肪组织病理切片显示，陈年六堡茶能减少肝细胞中脂滴的形成和抑制脂肪细胞膨大及脂肪的累积，呈剂量依赖关系。由于脂肪细胞大小以及脂肪组织累积的程度表现出与体重获得正相关，从而陈年六堡茶的摄入也表现出有效地控制试验小鼠的终体质量。综上表明，陈年六堡茶在正常剂量条件下能有效改善因高脂高糖饮食所致的小鼠脂质代谢紊乱和肝脏损伤。
陈智雄等[27]认为，年份黑茶的调节脂质代谢物质基础主要是茶多酚、茶褐素、茶多糖等物质以及微生物的代谢产物。已有研究指出，普洱茶中的微生物如土曲霉（Aspergillus terreus）等可产生有降血脂作用的洛伐他汀[30]， 茯砖茶的优势菌种冠突散囊菌（ Eurotiumcristatum）中也含有洛伐他汀[31]，六堡茶优势真菌种群是曲霉菌属（Aspcrgillus）和散囊菌属（Eurotium）[32]，但目前六堡茶微生物代谢产物降血脂方面的研究还未见报道。根据普洱茶中的土曲霉和茯砖茶的冠突散囊菌分别是曲霉菌属和散囊菌属的一种，六堡茶那些微生物的代谢产物也可能有降脂的作用成分，也就是说陈年六堡茶的儿茶素、茶褐素、茶多糖等物质以及微生物的代谢产物，甚至还有目前未知的陈化分解的新化合物一起构成了调节脂质代谢物质基础。
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